Tóm tắt: Sự hấp thu glucose chủ yếu thông qua hệ thống mannose phosphate transferase (PTS), có ái lực cao với glucose (Km=0,35 mM). Chọn các đột biến có khả năng chịu đựng 2-deoxyglucose (2DG) và thiếu hoạt động vận chuyển glucose phụ thuộc vào PEP, có thể phát triển trên môi trường sử dụng glucose làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất, tốc độ hấp thụ glucose giảm đáng kể do sử dụng hệ thống hấp thụ không PTS có ái lực thấp (Ks=11 mM). Phát triển trong môi trường nuôi cấy với áp suất thẩm thấu khác nhau, các tế bào hoang dã có tốc độ tiêu thụ glucose thấp hơn và tốc độ tăng trưởng cụ thể. Hoạt động PTS tương tự được hiển thị khi các tế bào của các nền văn hóa này được đo trong điều kiện tiêu chuẩn. Tuy nhiên, hoạt động PTS cho thấy mối tương quan với áp suất thẩm thấu khi các tế bào bị treo lại trong một bộ đệm với áp suất thẩm thấu khác nhau. Hiệu ứng ức chế này có thể giải thích sự suy giảm trong hấp thụ đường và tốc độ tăng trưởng quan sát thấy trong môi trường lên men thẩm thấu cao. Nhưng hệ thống vận chuyển glucose không phải PTS không bị ảnh hưởng bởi áp suất thẩm thấu môi trường. Sự ức chế tương tự đối với khả năng vận chuyển đường đã được quan sát thấy trong điều kiện sản xuất công nghiệp với sự gia tăng tương ứng áp suất thẩm thấu của môi trường tích lũy glutamate. Hiện tượng này do đó hạn chế quá trình lên men, vì giảm tỷ lệ cụ thể dẫn đến tăng tỷ lệ đường tiêu thụ để duy trì tế bào, đồng thời giảm năng suất sản phẩm.

Từ khóa: vận chuyển glucose; Áp suất thẩm thấu; lên men glutamate; Vi khuẩn Stizocera glutamate;

Nội dung nghiên cứu:

1, ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sức sống của hệ thống hấp thu glucose PTS

Hoạt động PTS được duy trì không đổi trong vòng 800mOsmol/Kg áp suất thẩm thấu, sau đó hoạt động PTS giảm tuyến tính khi áp suất thẩm thấu tăng lên. Hoạt động PTS ở áp suất thẩm thấu 1900mOsmol/Kg chỉ bằng 15% ở mức cao nhất.

2, ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên quá trình lên men glutamate

Sự tích tụ axit glutamic và các chất chuyển hóa thứ cấp gây ra sự gia tăng đáng kể áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy, và để duy trì độ pH không đổi, sự gia tăng này càng được làm trầm trọng thêm bởi việc bổ sung kiềm (trong trường hợp này là amoniac). Hiện tượng này đã được quan sát thấy trong chủng Corynebacter glutamate nhạy cảm với nhiệt độ 2262, có khả năng đạt được nồng độ sản phẩm cao (glutamate>85g/L) và áp suất thẩm thấu vượt quá 2000mOsmol · kg-1. Tỷ lệ tiêu thụ đường vẫn không thay đổi trong vài giờ đầu tiên, sau đó

Giảm dần. Để kiểm tra xem hoạt động suy yếu có liên quan đến sự gia tăng áp suất thẩm thấu do tích tụ glutamate hay không, sự đóng góp của hoạt động PTS vào tổng lượng đường được đo và sự đóng góp được đo trong vi khuẩn hoang dã Corynebacteria glutamate ATCC17965 là 4,5 mmol.g-1 · h-1. Trong các chủng sản xuất glutamate, tổng lượng đường hấp thu nhanh hơn, cho thấy hoạt động enzyme thẩm thấu cao hơn. Tỷ lệ hấp thu glucose đo được trong điều kiện không căng thẳng cho thấy enzyme thẩm thấu đóng góp tới 25% tổng lượng glucose hấp thu trong Corynebacteria glutamate 2262. Ảnh hưởng ức chế của căng thẳng thẩm thấu đối với hoạt động PTS được xác định bằng phương pháp đo in vitro của hệ thống vận chuyển PTS, và trong điều kiện bổ sung glucose (đóng góp không đáng kể của enzyme thẩm thấu) (glucose dư lượng thấp, tức là ít hơn 2g · l-1), có thể thấy sự sụt giảm trong tiêu thụ glucose rất gần với sự sụt giảm trong hoạt động PTS dự đoán (Hình 3a). Khi chiến lược bổ sung glucose duy trì nồng độ cao hơn (50 g · l-1) được áp dụng, sự cải thiện trong tiêu thụ glucose có thể là do hoạt động enzyme thẩm thấu và độ bão hòa cao của glucose có trong lò phản ứng đối với hệ thống này (Hình 3b). Dưới thanh này, tỷ lệ tiêu thụ glucose cao Dẫn đến sự xuất hiện sớm hơn của các chất chuyển hóa bổ sung, chẳng hạn như axit lactic.

3, Ảnh hưởng đến năng suất glutamate

Một khi áp suất thẩm thấu trong môi trường tăng lên, một trong những hậu quả của việc giảm hoạt động trao đổi chất là giảm đáng kể sản xuất glutamate vào cuối quá trình lên men. Sự suy giảm trong tiêu thụ glucose có thể gây ra sự suy giảm trong sản xuất glutamate, do sự gia tăng tỷ lệ glucose chuyển đổi thành CO2. Sản lượng CO2 gần như không đổi trong suốt giai đoạn sản xuất, cho thấy rằng năng lượng sinh hóa thu được từ quá trình dị hóa đường để đáp ứng nhu cầu duy trì tế bào không đổi, tỷ lệ thuận với sinh khối bên trong máy lên men,

Do đó, việc giảm tỷ lệ tiêu thụ đường đòi hỏi phải tăng tỷ lệ đường được sử dụng. Khi tính toán bằng cách sử dụng hệ số duy trì 0,6 mmol glucose/g tế bào/h của Corynebacteria glutamate, tỷ lệ glucose được sử dụng cho nhu cầu duy trì tế bào tăng từ 15% tổng lượng đường tiêu thụ trong giai đoạn đầu của sản xuất glutamate lên 40% khi áp suất thẩm thấu cao nhất trong giai đoạn lên men muộn (Hình 4). Sự suy giảm năng suất glutamate quan sát thấy trong giai đoạn sau của quá trình lên men phù hợp với những thay đổi trong dòng trao đổi chất carbon để duy trì nhu cầu. Tùy thuộc vào việc giảm nhu cầu oxy trao đổi chất trong quá trình suy giảm hoạt động trao đổi chất, việc kiểm soát nồng độ đường dư dựa trên sự thay đổi oxy có thể khôi phục một phần năng suất bị mất.

4. Thảo luận

Bài viết này minh họa rằng sự ức chế của quá trình lên men glutamate sau này có liên quan trực tiếp đến tác động kiểm soát của sự tích tụ sản phẩm và môi trường thẩm thấu đối với khả năng hấp thụ đường. Hiện tượng này không phải do sự thay đổi mức độ biểu hiện gen, mà là do sự thay đổi trong hoạt động sinh hóa của hệ thống vận chuyển trong điều kiện áp lực thẩm thấu. Hơn nữa, hiệu ứng này có thể đảo ngược vì một khi áp lực thẩm thấu được loại bỏ, các tế bào được rửa vẫn có thể khôi phục khả năng vận chuyển đường. Tương tự như vậy, khả năng vận chuyển đường tế bào phát triển bình thường giảm đáng kể khi treo nặng trong một bộ đệm có độ thấm cao. Khi áp suất thẩm thấu tăng lên, hiệu ứng sinh lý này có thể dẫn đến giảm khả năng tiêu thụ đường và tốc độ trao đổi chất chậm hơn. Vì các yêu cầu về năng lượng để duy trì sinh khối vẫn không thay đổi và trong nhiều trường hợp, năng lượng bổ sung sẽ được yêu cầu để đáp ứng cuộc chiến chống lại những căng thẳng như vậy, điều này cũng sẽ dẫn đến giảm năng suất sản phẩm. Lượng đường tiêu thụ ngày càng tăng sẽ được sử dụng trong sản xuất năng lượng và do đó sẽ bị mất dưới dạng carbon dioxide với chi phí giảm sản phẩm. Đối với quá trình lên men glutamate, cả sản lượng và năng suất đều giảm đáng kể khi áp suất thẩm thấu môi trường tăng lên. Các cơ chế sinh hóa gây ra sự suy giảm khả năng vận chuyển protein PTS vẫn chưa được xác định, nhưng có thể liên quan đến những thay đổi cấu trúc trong phức hợp protein/màng. Các chủng sản xuất glutamate hiệu quả hơn hoặc nhanh hơn sẽ đạt đến ngưỡng thẩm thấu nhanh hơn, điều này sẽ dẫn đến sản lượng có thể không tăng sau 24 giờ lên men. Do đó, sàng lọc các chủng có khả năng chịu áp lực cao là có lợi cho quá trình lên men, do đó đảm bảo các chủng công nghiệp đủ mạnh để duy trì hoạt động trao đổi chất cao khi đạt được năng suất cao. Một con đường khác để vượt qua sự ức chế trao đổi chất này là phát triển một hệ thống lên men có khả năng tích hợp quá trình chiết xuất hạ lưu để loại bỏ các sản phẩm khi quá trình lên men tích tụ.