Đối với việc phân phối gen cho các tế bào khó nhiễm, các học giả tại Đại học Quốc gia Singapore đã tạo ra một hệ thống phân phối gen nhúng bằng cách sử dụng công nghệ túi vi tế bào (mCVT), sử dụng máy đùn liposome của công ty Genizer có trụ sở tại Hoa Kỳ và công bố kết quả trên tạp chí Nanoscale. Tên đầy đủ của nguyên văn là: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Singapore đã giới thiệu một hệ thống nền tảng phân phối gen nhúng mới dựa trên công nghệ microcell vesicle mCVT. Hệ thống nền tảng phân phối gen này, được tạo ra từ sự hợp nhất của màng tế bào và lipid cation, được sử dụng để cải thiện hiệu quả truyền của các tế bào HTT khó truyền. Thành phần màng tế bào của túi vi tế bào mang lại tính đặc hiệu cho toàn bộ phức hợp cytosytosis, làm giảm độc tính tế bào phức tạp trong quá trình truyền nhiễm, trong khi lipid cation chịu trách nhiệm liên kết với vật liệu di truyền trong khi cung cấp tính toàn vẹn cấu trúc cho mCVT.

Nền

Phân phối gen là quá trình đưa DNA ngoại lai vào các tế bào nhân chuẩn. Chẳng hạn như chuyển gen trị liệu hoặc chức năng để thay đổi các quá trình tế bào trong các nghiên cứu cơ bản (ví dụ: khám phá thuốc và nghiên cứu cơ học về protein chức năng) và trong các ứng dụng lâm sàng (ví dụ: liệu pháp gen). Chuyển gen hiệu quả đòi hỏi không chỉ thành công trong việc đưa axit nucleic ngoại lai vào tế bào mà còn vận chuyển và biểu hiện tiếp theo của chúng trong tế bào. Đây là một nhiệm vụ đầy thách thức vì bản thân các phân tử DNA mang điện tích âm và do đó rất khó để được nội hóa bởi các tế bào ở dạng thông thường của chúng. Do đó, có một sự quan tâm lớn trong việc phát triển các hệ thống truyền gen hiệu quả. Trong vài thập kỷ qua, một số lượng lớn các hệ thống vectơ đã được khám phá, từ các hệ thống phân phối dựa trên virus đến các vectơ không phải virus. Mặc dù hiệu quả truyền nhiễm tương đối thấp đối với các vectơ phân phối gen không phải virus, nhưng nó hứa hẹn sẽ trở nên an toàn và chấp nhận lâm sàng, trong đó hệ thống lipid cation và nền tảng dựa trên polymer là những ví dụ chính. Bảng 1 tóm tắt những ưu và nhược điểm chính của thuốc thử hoặc phương pháp truyền nhiễm thường được sử dụng hiện nay.

Một hệ thống phân phối gen không virus lý tưởng sẽ cung cấp hiệu quả các phân tử DNA cần thiết cho một loại tế bào cụ thể với độc tính tế bào tối thiểu để đảm bảo biểu hiện tối đa của gen mục tiêu. Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, thuốc thử truyền nhiễm hiện có trên thị trường rõ ràng không đáp ứng được các tiêu chuẩn này, đặc biệt là khi chúng được sử dụng để truyền các tế bào khó truyền (HTT).

Tế bào HTT thường bao gồm tế bào gốc, tế bào gốc phôi và một số dòng tế bào vĩnh sinh như 3T3-L1 (tế bào mỡ tiền chuột), U937 (tế bào đơn nhân người), Jurkat (tế bào lympho T người), HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người), v.v. Theo thống kê, hiệu quả của việc sử dụng thuốc thử có sẵn trên thị trường để truyền plasmid cho các tế bào HTT thường không vượt quá 25%. Một trong những lý do cho tỷ lệ hấp thụ thấp của các tế bào HTT đối với các chất ngoại lai và plasmid là hoạt động trao đổi chất thấp của chúng. Ngoài ra, các tế bào này thường rất nhạy cảm với sự xáo trộn tế bào do thuốc thử chuyển nhiễm được sử dụng, có khả năng gây độc tế bào và cuối cùng là chết tế bào.

Gần đây, mối quan tâm đáng kể đã thu hút được sự chú ý vì khả năng các hệ thống phân phối có nguồn gốc từ tế bào có thể đưa các phân tử hàng hóa hoạt động đến vị trí mục tiêu một cách cụ thể. Trên thực tế, nhiều nghiên cứu đã khám phá việc sử dụng hệ thống phân phối thuốc (DDS) có nguồn gốc từ tế bào đơn nhân để phân phối thuốc hóa trị và plasmid DNA (pDNA) trực tiếp đến khối u hoặc DDS có nguồn gốc từ tế bào máu đỏ để kéo dài lưu thông máu và phân phối pDNA trực tiếp vào các tế bào máu. Người ta suy đoán rằng việc giữ lại thành phần màng tế bào của các tế bào mẹ sẽ mang lại cho các hệ thống phân phối thuốc dựa trên tế bào này khả năng xác định các tế bào mục tiêu cụ thể, có thể được thúc đẩy bằng cách trốn tránh khả năng nhận dạng của hệ thống miễn dịch của cơ thể.

Mặc dù có ý nghĩa điều trị đáng kể, tiềm năng đầy đủ của DDS dựa trên tế bào trong việc truyền gen phần lớn vẫn chưa được khai thác cho đến nay. Những thách thức chính cần được giải quyết bao gồm các quy trình tách/sản xuất thông lượng thấp và tẻ nhạt của DDS có nguồn gốc tế bào, chẳng hạn như dạng exosome, và các kỹ thuật tổng hợp/nạp gen tối ưu dưới mức. Vì vậy, trong khi các hệ thống này có vẻ có lợi thế về khả năng nhắm mục tiêu bên trong, chúng có những hạn chế lớn về năng suất và hiệu quả tải pDNA. Vì vậy, để khắc phục những hạn chế này, chúng tôi đề xuất phát triển một hệ thống phân phối gen nhúng mới bao gồm các thành phần màng tế bào và các thành phần lipid cation, trước đây để tăng cường nội hóa của các tế bào đích và sau này để tăng cường tải pDNA.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mô tả sự phát triển của công nghệ túi vi tế bào (mCVT), một nền tảng phân phối hỗn hợp mới thu được bằng cách hợp nhất lipid cation với màng tế bào. Để sản xuất mCVT, các tế bào đầu tiên được xử lý bằng dung dịch thấm nước thấp để thu được các tế bào ma (CG không có tế bào chất trên tế bào bào quan), như Goh và cộng sự mô tả. Các giải pháp thẩm thấu thấp tạo ra một lỗ hổng ngắn trên màng plasma, cho phép loại bỏ nội dung bên trong tế bào trong khi vẫn duy trì tính toàn vẹn của màng. CG từ các tế bào khác nhau lơ lửng trong môi trường nước được sử dụng để hydrat hóa màng lipid DOTAP khô, sau đó được ép đùn bằng máy đùn liposome, cung cấp kích thước thủy động lực học trung bình tương tự như liposome DOTAP được ép đùn và mCVTs của tiềm năng Zeta. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng mCVT có thể kết hợp với plasmid và được nội hóa bởi các tế bào mục tiêu với độc tính tế bào tối thiểu. Điều thú vị là khi các mCVT được tạo ra từ các loại tế bào khác nhau được so sánh trong ống nghiệm, chúng cho thấy hiệu quả truyền nhiễm cao hơn đáng kể đối với các loại tế bào mà mCVT có nguồn gốc.

Phương pháp&Kết quả

Các tế bào ma (CG không có tế bào chất và màng tế bào bào quan) được chuẩn bị để đảm bảo tính lặp lại và tình trạng an toàn của mCVT.

Phương pháp và kết quả hơi

Sản xuất và phân tích tính năng của mCVT.

Tương tự như sản xuất liposome, phương pháp màng lipid được sử dụng để sản xuất mCVT. Màng DOTAP hydrat hóa với CG để tạo thành liposome đa phân tử lớn bao bọc CG. Hệ thống treo này được ép ra và màng bùn từ CG chứa lipid DOTAP (như trong Hình 3A). Theo phương pháp mà nhóm chúng tôi đã thiết lập trước đây, người ta đã chứng minh rằng sau khi ép, mCVT được tạo ra như vậy bao gồm sự hợp nhất của màng lipid và CG. Nói chung, mCVT có sự phân bố kích thước tương tự như liposome. Để chứng minh tính mạnh mẽ và linh hoạt của phương pháp này trong các dòng tế bào khác nhau, mCVT được tạo ra bằng cách sử dụng CG từ các dòng tế bào khác nhau, chẳng hạn như một số tế bào HTT (tức là 3T3-L1) và các tế bào không ung thư (tức là HEK293 và RAW264.7). Như thể hiện trong Hình 3B, kích thước thủy động lực học và PDI của các mCVT khác nhau thường nằm trong phạm vi 400 nanomet (PDI ∼ 0,4), tương tự như liposome DOTAP (PDI ∼ 0,2) được sản xuất bằng cách sử dụng cùng một phương pháp đùn. Trong Hình 3C, các giá trị tiềm năng zeta tương tự (khoảng 30 mV đến 40 mV) đã được quan sát thấy trong các công thức khác nhau, cho thấy phương pháp này áp dụng phổ biến cho CG được tạo ra từ các dòng tế bào khác nhau. Điều thú vị là khi mCVT3T3-L1 ghép đôi với pDNA, sự phân bố kích thước của nó tương tự như mCVT không ghép đôi, trong khi điện thế zeta tổng thể trở thành tiêu cực, có thể chỉ ra sự thành công của việc ghép đôi (vì pDNA mang điện âm trung hòa mCVT mang điện dương).

Sơ đồ của A. mCVT, liên quan đến sự hợp nhất của hồn ma tế bào và liposome làm từ màng hydrat hóa.

Kích thước thủy động lực học của mCVT khác nhau và mCVT3T3-L1 với plasmid so với liposome DOTAP. Tất cả các mCVT có kích thước nhỏ hơn 500 nanomet.

C. Tiềm năng Zeta của mCVT khác nhau và mCVT3T3-L1 với plasmid so với liposome DOTAP. Tất cả mCVT đều có tiềm năng Zeta trên+30 mV, ngoại trừ mCVT3T3-L1 với DNA plasmid (5 µg), cho thấy tiềm năng Zeta âm do tương tác với DNA plasmid. Dữ liệu đại diện cho trung bình ± SD (n=3).